Nuovo antigene | Misuratore di portata Tianjin Co., Ltd

Natura volume 610, pagine 752–760 (2022)Citare questo articolo

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Stabilire e mantenere la tolleranza agli autoantigeni o agli antigeni estranei innocui è vitale per la preservazione della salute dell’organismo. All'interno del timo, le cellule epiteliali timiche midollari (mTEC) che esprimono il regolatore autoimmune (AIRE) hanno un ruolo critico nell'autotolleranza attraverso la cancellazione delle cellule T autoreattive e la promozione dello sviluppo delle cellule T regolatorie timiche (Treg)1,2,3,4. Entro poche settimane dalla nascita, nella periferia si verifica un'ondata separata di differenziazione delle cellule Treg in seguito all'esposizione agli antigeni derivati dalla dieta e dal microbiota commensale5,6,7,8, ma i tipi cellulari responsabili della generazione di cellule Treg periferiche (pTreg) hanno non è stato identificato. Qui descriviamo l'identificazione di una classe di cellule presentanti l'antigene RORγt + chiamate cellule Thetis, con caratteristiche trascrizionali sia di mTEC che di cellule dendritiche, comprendente quattro sottogruppi principali (TC I – TC IV). Scopriamo un'ondata di sviluppo delle cellule di Thetis all'interno dei linfonodi intestinali durante una finestra critica nei primi anni di vita, in coincidenza con l'ondata di differenziazione delle cellule pTreg. Mentre TC I e TC III esprimevano il caratteristico fattore nucleare mTEC AIRE, TC IV mancava di espressione AIRE ed era arricchito per le molecole richieste per la generazione di pTreg, inclusa l'integrina αvβ8 che attiva il TGF-β. La perdita del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHCII) o dell'ITGB8 da parte delle cellule di Thetis ha portato a una profonda compromissione della differenziazione pTreg intestinale, con conseguente colite. Al contrario, l'espressione di MHCII da parte delle cellule linfoidi innate del gruppo 3 RORγt+ (ILC3) e delle cellule dendritiche classiche non era né sufficiente né richiesta per la generazione di pTreg, implicando ulteriormente TC IV come cellula tollerogenica presentante l'antigene RORγt+ con una funzione essenziale nei primi anni di vita. I nostri studi rivelano percorsi paralleli per l'instaurazione della tolleranza agli antigeni propri ed estranei rispettivamente nel timo e nella periferia, contrassegnati dal coinvolgimento di programmi cellulari e trascrizionali condivisi.

Nel timo, un lignaggio distinto di cellule epiteliali stabilisce la tolleranza agli antigeni self attraverso la cancellazione delle cellule T autoreattive e la promozione della differenziazione delle cellule Treg1,2,3,4. Queste funzioni delle mTEC sono mediate in parte attraverso l'espressione di AIRE, che regola l'espressione ectopica degli antigeni ristretti nei tessuti1. Un altro importante sito di induzione della tolleranza risiede nel tessuto linfoide intestinale, dove il sistema immunitario in via di sviluppo del bambino è esposto a molti nuovi componenti alimentari e ai microbi che colonizzano dopo lo svezzamento. Stabilire una relazione armoniosa tra ospite e microbiota in questa prima finestra di sviluppo della vita è fondamentale per prevenire l’insorgenza successiva di disturbi immuno-mediati7,9. Fondamentale per stabilire la tolleranza ai microbi intestinali è la differenziazione delle cellule T naive in cellule Treg (pTreg) generate perifericamente dopo l'incontro con antigeni di derivazione commensale5,6,10,11. Tuttavia l’identità della cellula presentante l’antigene (APC) che promuove la differenziazione delle cellule pTreg non è nota. La finestra temporale ristretta per stabilire l'omeostasi immunitaria intestinale suggerisce la presenza di un APC tollerogenico limitato allo sviluppo all'interno della nicchia intestinale neonatale.

Le cellule pTreg extra-timiche, distinte dalle loro controparti timiche per l'espressione del recettore nucleare orfano RORγt, nascono nei linfonodi mesenterici (mLN) in risposta agli antigeni batterici commensali e hanno un ruolo fondamentale nella soppressione delle risposte immunitarie infiammatorie contro i microbi intestinali6,11. Al contrario, i topi carenti di presentazione dell'antigene ristretto MHCII da parte delle cellule RORγt+ (MHCIIΔRORγt), sviluppano una grave infiammazione intestinale perché non stabiliscono tolleranza ai batteri commensali12, suggerendo una potenziale connessione tra APC RORγt+ e generazione di cellule RORγt+ pTreg. Per affrontare questa possibilità, abbiamo analizzato i topi MHCIIΔRORγt a tre settimane di età, quando le cellule pTreg si accumulano nell'intestino5,6. Abbiamo osservato una marcata riduzione delle cellule RORγt + pTreg all'interno della mLN e della lamina propria del colon, insieme a un'espansione delle cellule effettrici T CD44hi (Teff) (Fig. 1a-d e Dati estesi Fig. 1a). All'età di otto settimane, questi topi hanno mostrato una riduzione grave e sostenuta delle cellule RORγt + pTreg insieme all'espansione delle cellule T helper 17 (TH17) del colon (Fig. 1e e Dati estesi Fig. 1b), in linea con studi precedenti che dimostrano un'importante ruolo delle cellule RORγt+ pTreg specifiche del patobionte nella soppressione delle cellule infiammatorie TH1711. L'analisi istologica ha dimostrato una colite grave con marcato infiltrato cellulare infiammatorio, ulcerazione della mucosa e perdita di cripte (Fig. 1f, g), confermando un ruolo critico per le APC RORγt + nella prevenzione delle risposte immunitarie intestinali disregolate.

1.5, adjusted P < 0.01) for each Thetis cell cluster. h, Dot plot showing expression of selected cell-surface markers that are differentially expressed between Thetis cell subsets. i, Gating strategy for identification of Thetis cell subsets. j, Intracellular expression of AIRE protein by Thetis cell subsets; each symbol represents an individual mouse (n = 4). k, summary of TC I–TC IV phenotypes. Plots in i are representative of n = 6 mice from 3 independent experiments. Data in b,e,j are representative of 3 independent experiments. Box plots in c indicate median (centre line) and interquartile range (hinges), whiskers represent minimum and maximum values, and dots represent outliers./p>

50,000 cells (viability 95%) were lysed for 4 min and resuspended in Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics, 2000207). Lysis efficiency and nuclei concentration was evaluated on Countess II automatic cell counter by trypan blue staining. Nuclei (9,660 per transposition reaction) were loaded, targeting recovery of 6,000 nuclei after encapsulation. After the transposition reaction, nuclei were encapsulated and barcoded. Next-generation sequencing libraries were constructed following the manufacturer’s instructions, and were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 system./p>

1,000 and < 50,000), the number of detected genes (>500 and < 6,000), and the fraction of mitochondrial transcripts (<15%). Barcodes were further filtered based on the number of scATAC-seq fragments (3.5 < log10(number of fragments) < 4.5) and transcription start site enrichment score (>4). Arrow files were created from the scATAC-seq fragments using ArchR v1.0.154, and doublets were identified and removed with default parameters. Finally, any genes detected in <2 cells in the scRNA-seq data were discarded, leaving 20,779 genes. After clustering, the scRNA-seq data (described in ‘Dimensionality reduction, cell clustering, and visualization’), and based on the expression of marker genes, we identified 5 minor contaminant clusters (glial cells; cluster 17, plasmacytoid dendritic cell; cluster 18, Rorc–/lo CCR7+ dendritic or Thetis cell; cluster 19, mixed monocyte/cDC1; cluster 20, and macrophage; cluster 21) which were excluded from downstream analyses. In total, 10,145 cells remained, with a median scRNA-seq library size of 3,150 and a median of 13,885 scATAC-seq fragments./p>50,000), number of detected genes (>1,300), and the fraction of mitochondrial transcripts (<8%). Finally, genes detected in <2 cells were discarded. A total of 481 cells remained, with a median library size of 924,319 from 27,195 genes./p>1.5) and adjusted P value (<0.01). Ribosomal and mitochondrial genes were removed from the final list of genes reported or visualized. Where stated, the top DEG markers were subsequently selected for each group, based on fold change./p>

1.3, adjusted P < 0.01) comparing the scRNA-seq clusters in a one-vs-rest test, that were also expressed in the microarray data. The proliferating and progenitor clusters were excluded from the differential expression test, and the LTi clusters were grouped together. For visualization of results, only cell lineages containing a cell type with > 0.25 cosine similarity with either Thetis cell or ILC3 clusters were plotted./p>

1.3, adjusted P < 0.01) identified in a one-vs-rest differential expression test for non-proliferating Thetis cell clusters (2–5), that were also expressed in the thymic epithelial cells. Among individual clusters of thymic epithelial cells defined in the original dataset, we identified 2 clusters of transit amplifying AIRE+ cells (clusters 25 and 26), distinguished by signature gene expression including cell cycle genes./p> 1.5, adjusted P < 0.01), we identified orthologous human genes that were uniquely mapped by gprofiler2 and computed enrichment scores for Thetis cell subset gene signatures for each human cell./p>0.001 of the sequence) were filtered. Regions from all groups were compiled and overlapping regions were merged to their union, resulting in a non-overlapping set of 176,942 peaks. A peak-by-cell count matrix was created by ArchR with a ‘ceiling’ value of 4 for the counts to avoid strong biases./p> 1 h at room temperature, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in acetone, and processed for Epon embedding. Ultrathin sections (60–65 nm) were counterstained with uranyl acetate and lead citrate. Images were taken with a transmission electron microscope (Tecnai G2–12; FEI) equipped with a digital camera (AMT BioSprint29)./p>

1.5, P < 0.01). d, Expression score of cell-cycle genes for each scRNA-seq cluster. e, Dot plot showing expression of myeloid genes. f, Flow cytometry of Zbtb46 (GFP) expression in ILC3 subsets from mLN of 3-week-old Zbtb46GFPRorgtcreR26lsl-tdTomato mice. Representative of n = 4 mice from two independent experiments. g-h, CellTypist derived cell labels for cell clusters from Fig. 2g, using a broad classification (g) or finer cell type annotation (h). i, Correspondence between cell labels for scATAC-seq and scRNA-seq./p>

1.5, adj. P < 0.01) between Aire+ mTEC and TC I. i, Bar graph showing log-normalized expression of Ptprc and Rorc genes in Aire+ mTECs and TCs. j, Flow cytometry of RORγt expression in Aire+ mTECs isolated from P18 RorcVenus-creERT2AireGFP mice. k, Heatmap reporting scaled expression values for top differentially expressed genes (FC > 1.5, adj. P < 0.01) between indicated SS2 clusters (f). Data in a,b are representative of > 3 independent experiments. Data in j representative of n = 5 mice from two independent experiments./p>